Oбразование микробной плёнки

25. jaan 2005


Для изучения образования микробной плёнки in vivo исследуемые носили в течение 5 дней шины с закреплёнными на них пластинками из 6 различных реставрационных материалов. После 5 дней была проведена прижизненная окраска и проведена оценка содержания микрофлоры в составе налёта при помощи лазерной сканирующей микроскопии. Помимо этого были изучены такие параметры как толщина плёнки (мкм) и площадь, покрытая налётом

Oбразование микробной плёнки

Бактериальный налёт

Данное исследовавание важно в изучении вторичного кариеса, который, как известно поражает ткани зуба вокруг уже существующих реставраций, поэтому изучение влияния пломбировочного материала на микрофлору в полости рта является очень важным. Данное исследование было проведено с использованием сканирующей лазерной микроскопии, так как изучение плёнки в отдельности от поверхности является технически трудной задачей вследствие повреждения плёнки. Этот метод позволяет детально визуализировать микробиологические образцы в тех случаях, когда применение фазово-контрастной или флуоресцентной микроскопии ограничено.

В данном исследовании ставилось основной задачей оценить скопление мертвых и живых микроорганизмов, а также толщину биоплёнки на 6 различных материалах.

В исследовании участвовало 3 студента факультета стоматологии (возраст 26-30 лет) с высоким уровнем гигиены полости рта. По индексу зубного налёта эти студенты были отнесены к группе, в которой налёт образуется медленно. Ни у одного из участников не было зарегистрировано признаков кариеса или деструктивного периодонтита, помимо этого ни один из них не подвергался лечению антибиотиками в течение последних 6 месяцев. Каждый из участников перед началом исследования прошёл профессиональную профилактику, включая чистку зубов.

Oбразование микробной плёнки

Налёт, окрашеный красителем

Каждый из участников должен был носить индивидуально сделанную акриловую шину для верхней челюсти в течение 5 дней. Так как участники были отнесены к группе с медленным образованием налёта, этот срок был выбран оптимальным для его получения. Материалы, предназначенные для изучения были приготовлены в стандартном варианте (5 мм. в диаметре, толщиной в 1.5 мм). Были исследованы следующие материалы: амальгама (Vivacap; Vivadent Dental, Elllwangen, Germany), золото ( Degulor M; Degussa ? Frankfurt Germany), керамика ( IPS Empress; Ivoclar Elllwangen, Germany), композит (Pertac II; ESPE, Seefeld, Germany), компомер (Compoglass; Vivadent Dental ), стеклоиономер (Fuji 9, GC, Maintal-Dorningheim, Germany). Все материалы прошли одинаковую обработку поверхности: обработка при помощи абразива с грануляцией 1000 мкм., для придания максимальной гладкости. После этой обработки образцы были отполированы согласно инструкциям производителей при помощи соответствующих полировочных наборов (набор для полировки амальгамы, набор для композитов, набор для стеклоиономеров, набор для обработки эмали; SHOFU dental, Ratingen, Germany). Пластинки хранились в физиологическом растворе в термостате (37 0С) в течение 12 недель для имитации старения.

Для сбора плёнки in vivo, пластинки были помещены с щёчной стороны шин, таким образом чтобы плёнка образовывалась беспрепятственно, а во время приёмов пищи и при чистке зубов пластинки хранились в тёплой воде 370С. После 5 дней пластинки были изъяты, промыты тёплым физиологическим раствором. После этого плёнку подвергли прижизненной окраске при помощи флюоресцина диацетата и этидия бромида для визуализации процента живых (зелёный цвет) и мёртвых бактерий (красный цвет). Живые клетки перерабатывают краситель до флюоресцина, который даёт зелёное свечение, адсорбируясь на поверхностной мембране. Мёртвые клетки не могут метаболизировать флюоресцина диацетат, а этидия бромид связывается с ядрами мёртвых клеток, давая красное свечение.

После этого окрашивания образцы были повторно промыты, просушены -2 мин. при температуре 370С и помещены в фиксатор, содержащий толуин/паралоид, для улучшения качества снимков. После этого был проведён анализ плёнок при помощи лазерной сканирующей микроскопии.

Оптические участки в 1мкм из центральной части каждого из образцов были изучены. Для изучения цвета была применена программа (FLUORO), оценивающая процентное содержание зелёного и красного цветов. Толщину плёнки определяли посредством счёта секций в которых были видны бактерии.

Результаты
Жизнеспособность микроорганизмов в образцах : амальгама, золото, компомер, стеклоиономер оказалась нулевой или отмечалась, но на низком уровне. Для композита этот показатель варьировал от 4 до 21%. На керамике этот показатель оказался наибольшим (34-86%).

Толщина плёнки варьировала от1мкм на композите и до 17 мкм на амальгаме. То же самое отмечалось по отношению к площади покрытой поверхности - почти 100% - на амальгаме и только 6% на стеклоиономере. Помимо этого рассматривалось соотношение покрытия поверхности образца и жизнеспособности микроорганизмов: металлические образцы и компомер показали наибольшие показатели покрытия поверхности с наименьшим уровнем жизнеспособности микроорганизмов, в то время как композит и особенно керамика показали наименьшее поверхностное покрытие с наивысшей жизнеспособностью микроорганизмов.

первый слой налёта на материалах А-амальгама, В-золото, С-композит, D-керамика, Е-компомер, F-стеклоиономер. (увеличение в 200 раз)

Жизнеспособность (%) в различных слоях плёнки на разных материалах.

Толщина плёнки/материал Образец 1 3 5 7 9 11 13 15 17
Амальгама 1
2
3
0.09
0.00
1.34
0.01
0.00
1.30
0.01
0.00
1.32
0.00
0.00
1.49
-
0.00
1.05
-
-
0.78
-
-
0.63
-
-
0.57

-
-
0.43

Золото 1
2
3
0.00
0.00
0.00
0.00
0.00
0.00
-
0.00
0.00
-
-
0.00
-
-
0.00
-
-
0.00
     
Керамика 1
2
3
33.98
тр.оц.*
39.79
39.29

38.92

86.08

76.00

           
Композит 1
2
3
3.72
9.42
тр.оц.*

10.94

20.92
           
Компомер 1
2
3
Тр.оц.*
4.44
1.83

7.37
2.18
             
Стеклоиономер 1
2
3
1.42
1.44
0.99

2.76
1.74
             


Тр.оц.- трудно оценить.

Сравнение поверхностного покрытия (%), жизнеспособности (%) и толщины (мкм).

Параметр Образец Амальгама Золото Керамика Композит Компомер Стеклоиономер
Покрытие поверхности(%) 1
2
3
100
100
100
55.9
98.3
97
27.9
тр.оц.
92
44.2
81.4
тр.оц.
Тр.оц.
94.2
95.3
6.2
89
93.9
Жизнеспособность (%) 1
2
3
0.1
0.0
1.5
0.0
0.0
0.0
86.1
тр.оц.
76.0
3.7
28.8
тр.оц.
Тр.оц.
7.4
2.2
1.4
2.8
1.7
Толщина плёнки
(мкм)
1
2
3
7
9
17
3
5
11
5
тр.оц.
5
2
6
тр.оц.
Тр.оц.
3
4
1
4
4

Материалы, связанные с результатами
Все тестированные материалы аккумулируют на поверхности первично мёртвую флору. В то время, как хорошо известно, что амальгама выделяет ионы, которые убивают бактерии в налёте, информация касательно золота и его сплавов относительно редка. Однако некоторые публикации показывают, что даже на поверхности, которая не соприкасалась с золотом, бактерии были мертвы или повреждены. С другой стороны известно, что стеклоиономеры выделяют фтор-ионы, которые могут повлиять на рост или жизнеспособность бактерий полости рта. Исключения касательно жизнеспособности прикрепляющейся микрофлоры выявлены в образцах керамики и композита. В то время, как бактериальная плёнка на композите выявила жизнеспособность от 4 до 21% , на образце керамики этот показатель достигает 34-86%, что превосходит даже показатели для эмали. Данных по жизнеспособности микрофлоры на керамической поверхности не так много.

Лишь в нескольких ранее проведённых исследованиях измерялась поверхность, покрытая микробной плёнкой. На винирах изготовленных из композита плёнка покрывала 35% поверхности уже через 4 дня, в то время как на металлических поверхностях было покрыто 40% площади. В данном исследовании металлические поверхности и компомер обнаружили высокий процент поверхностного покрытия налётом, в то время как композит, стеклоиономер и керамика показали сильные различия (см. табл.)Можно было ожидать, что на поверхностях, которые более всего покрываются налётом, будет и большее число живых бактерий. Однако композит и керамика показали тенденцию к уменьшенному покрытию поверхности и при этом выявлена повышенная жизнестойкость. Другое соотношение было отмечено между покрытием поверхности и толщиной плёнки. Независимо от площади покрытия толщина плёнки была достаточно небольшой (менее 10мкм). Особенно это видно у керамики, которая выявила небольшое покрытие площади и небольшую толщину.

При сравнении толщины плёнки с жизнеспособностью было выявлено, что даже при совершенно мёртвых бактериях на металлических поверхностях, плёнка достигала 17 мкм. В противоположность этому плёнка, содержащая живые микроорганизмы достигала толщины 5 мкм.

Oбразование микробной плёнки

Бактериальный налёт

В получении данных результатов могли сыграть свою роль :
1) физические параметры, как поверхностная шероховатость материала
2) преимущественное притяжение поверхностью мёртвых микроорганизмов
3) смерть микроорганизмов после прикрепления, или реальная бактерицидность реставрационных материалов